PCR quantitativo em tempo real

Mosco del dengue

O diagnóstico clínico é difícil de ser realizado principalmente na fase aguda da doença em que os sintomas são muito similares aos de outras infecções febris agudas, ficando a cargo do laboratório o diagnóstico definitivo.

Os métodos sorológicos para detecção de anticorpos IgM/IgG são os mais amplamente utilizados, mas inadequados para diagnóstico precoce uma vez que detectam anticorpos a partir do sexto dia do início dos sintomas. Os métodos moleculares estão sendo cada vez mais utilizados para o diagnóstico precoce por serem mais rápidos e sensíveis que a sorologia e o isolamento viral.

As técnicas moleculares, cujo objetivo é a detecção do genoma viral, têm importante papel no diagnóstico da dengue uma vez que são capazes de identificar o vírus na fase aguda da doença e, em algumas metodologias, quantificar a carga viral.

Entre os métodos mais utilizados podemos citar a hibridização e a transcrição reversa combinada à reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) convencional e em tempo real. A hibridização de ácidos nucléicos é aplicável tanto para amostras clínicas quanto para tecidos fixados provenientes de biopsias ou autopsias. Devido sua complexidade técnica, a hibridização é de difícil aplicação na rotina sendo mais utilizada como ferramenta de pesquisa.

A RT-PCR convencional é um método que possibilita a amplificação de sequências genômicas específicas de RNA delimitadas por iniciadores (primers). A aplicação de técnicas de fluorescência à RT-PCR, juntamente com instrumentação adequada, capaz de combinar amplificação, detecção e quantificação levou ao desenvolvimento de uma variação deste método denominado RT-PCR em tempo real.

A RT- PCR em tempo real, assim como a convencional, possibilita a amplificação de fragmentos genômicos, contudo a detecção dos produtos é feita diretamente na plataforma de instrumentação, utilizando marcadores fluorescentes e métodos sensíveis de mensuração da fluorescência emitida. O método não requer manipulação após a amplificação, sendo por isso chamado de sistema fechado ou homogêneo. As principais vantagens deste sistema homogêneo são: redução do tempo necessário para a realização do teste e baixo risco de contaminação com o produto amplificado, além disso, este método permite a quantificação da carga viral por comparação com uma curva padrão.

Durante a fase exponencial de amplificação é possível determinar um valor de intensidade de fluorescência, no qual todas as amostras podem ser comparadas. Este valor é denominado threshold ou limiar e é calculado em função da quantidade de fluorescência basal (background). Neste ponto, o sinal de fluorescência gerado por cada amostra é significativamente maior que a fluorescência basal.

A quantidade de ciclos de PCR requerida para que cada amostra emita fluorescência suficiente para alcançar este limiar pré-estabelecido é chamado de cycle threshold (Ct), o qual é inversamente proporcional à quantidade inicial do alvo presente na reação. A fluorescência emitida é captada pelo sistema óptico do termociclador e transmitida para um computador onde o software faz a análise final dos dados. A RT-PCR em tempo real apresenta sensibilidade maior que o isolamento e a RT-PCR convencional e equivalente à nested RT-PCR convencional. Várias estratégias de marcação vêm sendo utilizadas para detecção do fragmento amplificado, algumas usam substâncias fluorescentes que se ligam ao DNA dupla fita como SYBR green, e outros usam sondas marcadas.

As estratégias que utilizam sondas marcadas são altamente sensíveis e específicas. As três metodologias mais utilizadas são ensaio fluorogênico da atividade 5’nuclease (TaqMan®), sonda de hibridação molecular beacons (oligonucleotídeos que formam uma estrutura secundária entre as extremidades 5’ e 3’) e sonda de hibridação FRET (fluorescence resonance energy transfer). Estas sondas são desenhadas com base na sequência do fragmento alvo a ser amplificado e contêm um corante fluorescente ligado ao seu terminal 5’ (reporter) e um inibidor da fluorescência (quencher) ligado ao seu terminal 3’. Durante o processo de amplificação a sonda se liga a uma região específica do produto amplificado. Após a hibridação o reporter e o quencher são separados ocorrendo assim a emissão de fluorescência que é diretamente proporcional à quantidade do DNA alvo presente na amostra.

Trabalhos usando TaqMan® descrevem sua capacidade de detectar e quantificar a carga viral por RT-PCR numa única etapa. Porém, a grande desvantagem das estratégias que utilizam sondas marcadas é o seu elevado custo.

As estratégias que utilizam fluoróforos como o SYBR Green são baseadas na ligação deste corante com o DNA de dupla fita amplificado na reação, o que garante sua sensibilidade, mas com uma especificidade inferior ao daqueles que usam sondas marcadas.

A especificidade do produto amplificado é determinada pela análise da curva de dissociação, a qual permite calcular a temperatura de desnaturação (temperatura de melting - Tm) do produto amplificado que depende do tamanho e da sequência da mesma.

Um grupo de pesquisa descreveu recentemente uma RT-PCR, com base no SYBR Green, simples e altamente sensível para detecção gênero específica do vírus da dengue. Considerando que existem quatro sorotipos do vírus da dengue, é de suma importância, principalmente do ponto de vista epidemiológico, a tipificação do vírus circulante. Chutinimitkul et al. (2005), desenvolveram um método de RT-PCR em tempo real, baseado no SYBR Green, capaz de detectar o sorotipo viral, porém tal método é realizado em duas etapas, síntese de cDNA seguida de PCR em tempo real o que torna mais laborioso seu uso na rotina. O problema de se realizar duas etapas foi eliminado na RT-PCR em uma única etapa realizada por Chien et al. (2006) e Shu et al. (2003). Entretanto, apesar de realizarem o ensaio em uma única etapa, detectam em um tubo de reação apenas o sorogrupo dengue, enquanto que outros quatro tubos devem ser utilizados para determinar os sorotipos. Este problema foi minimizado por Yong et al. (2007) que desenvolveram uma RT-PCR em tempo real com SYBR Green com primers para os quatro sorotipos em uma única etapa em um único tubo de reação.

A vantagem do uso do SYBR Green em lugar da sonda marcada é o menor custo. Demonstrou-se que o uso do SYBR Green reduziu os custos com o diagnóstico em cerca da metade quando comparado com outros métodos que usam sondas.

 

Desenho dos primers

 

Os primers para detecção específica dos sorotipos foram desenhados com base na extremidade 5’ do genoma viral. Os primeiros nucleotídeos desta extremidade são altamente conservados entre os quatro sorotipos, por este motivo, optou-se por utilizar como primer sense o 5 ́UTR-S (5’-AGT TGT TAG TCT ACG TGG ACC GA-3’) que reconhece os primeiros 23 nucleotídeos dos quatro sorotipos. Os primers complementares, específicos para cada sorotipo, foram desenhados com base na região localizada entre os nucleotídeos 303 e 791, a qual é variável entre os sorotipos. Para isto, foram comparadas sequências nucleotídicas correspondentes a vírus representativos dos quatro sorotipos depositadas na base de dados do GenBank.

 RT-PCR em tempo real em única etapa

A mistura de reação continha:

·       12,5μl 2X SYBR green,

·       0,5μl SuperScriptTM III RT/Platinum® Taq Mix,

·       5μl de RNA,

·       0,2μM, 0,4μM ou 0,6μM do primer FG1 e de cada um dos primers sorotipo específicos para dengue (separados ou juntos em um único tubo) ;

·       água destilada livre de DNase/RNase até volume final de 25μl.

 

A amplificação foi realizada a 50oC por 1200 segundos (RT), seguida de uma incubação de 95oC por 300 segundos e 45 ciclos de 95oC por 15 segundos, 50 a 60oC por 40 segundos e 72oC por 30 segundos (PCR).

Para determinar a especificidade do produto amplificado foi calculada a temperatura de melting (Tm) através da análise da curva de dissociação. Os produtos obtidos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,8% para confirmação do tamanho.

 

Resultados

A especificidade de cada primer foi avaliada testando os mesmos contra sorotipos virais diferentes daqueles para os quais foram desenhados.

Aqueles primers que amplificaram o genoma de outro sorotipo, apresentando Tm similar àquela do próprio sorotipo, foram considerados inespecíficos.

Sete primers foram considerados específicos, isto é, não detectaram outro sorotipo ou apresentaram produtos de amplificação com Tm diferente da esperada para o próprio sorotipo

 

Fonte: pcr-elisa

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